間葉系幹細胞

局所幹細胞の中でも、間葉系幹細胞（MSC）は特別な位置を占めており、その派生細胞は人体のあらゆる臓器や組織の間質基質を構成しています。MSC研究の主導権は、ロシアの生物学界の代表者にあります。

前世紀半ば、A. フリーデンシュタインの研究室において、骨髄由来の多能性間質幹細胞の均一培養が初めて単離されました。基質に付着した間葉系幹細胞は、長期間にわたり高い増殖強度を維持し、基質への固定後に低播種密度で培養すると、貪食活性を持たない線維芽細胞様細胞のクローンを形成しました。MSCの増殖は停止し、in vitroにおいて骨、脂肪、軟骨、筋肉、または結合組織細胞へと自発的に分化しました。その後の研究により、様々な哺乳類種の骨髄間質由来線維芽細胞様細胞の骨形成能とコロニー形成能が確立されました。in vivo実験では、コロニー形成性線維芽細胞様細胞の異所性移植および同所性移植の両方が、骨、軟骨、線維組織、および脂肪組織の形成をもたらすことが示されています。骨髄間質幹細胞は、高い自己複製能力と単一細胞株内での多面的な分化を特徴とするため、多能性間葉系前駆細胞と呼ばれます。

注目すべきは、間葉系幹細胞に関する 45 年以上の基礎研究により、その派生物を臨床現場で使用するための現実的な条件が整えられたことです。

今日では、人体のすべての組織が、増殖、遊走、分化、成熟の過程を経て、様々な細胞株の幹細胞から形成されることは疑いようがありません。しかしながら、最近まで、成体生物の幹細胞は組織特異的である、すなわち、その細胞が局在する組織においてのみ、特殊な細胞株を産生できると考えられていました。この概念的立場は、造血幹細胞が末梢血の細胞成分だけでなく、肝臓の卵円細胞にも分化するという事実によって反駁されました。さらに、神経幹細胞は、ニューロンとグリア細胞の両方、そして造血前駆細胞の初期の分化系を生じさせることができることが判明しました。一方、通常は骨、軟骨、脂肪組織の細胞成分を産生する間葉系幹細胞は、神経幹細胞へと分化することができます。成長、生理的、そして修復的な組織再生の過程において、組織非特異的な幹細胞の予備群から、分化に関与しない前駆細胞が生成されると考えられています。例えば、筋組織の修復は、間葉系幹細胞が骨髄から骨格筋へ移動することで実現されます。

幹細胞のこのような互換性はすべての研究者に認められているわけではありませんが、細胞移植の供給源および遺伝情報の細胞ベクターとしての間葉系幹細胞の臨床応用の可能性は、もはや誰からも異論を唱えられていません。また、比較的容易に分離・増殖可能な骨髄間質幹細胞の多分化能についても異論はありません。同時に、骨髄間質幹細胞の潜在的な多能性に関する報告は、科学文献に次々と掲載されています。その証拠として、特定の分化転換誘導因子の影響下でMSCが神経細胞、心筋細胞、肝細胞へと変化する研究プロトコルが挙げられています。しかしながら、初期胚発生期からの遺伝子の反復活性化および発現の可能性について深刻な疑問を抱く科学者もいます。同時に、間葉系幹細胞の多分化能をES細胞の多能性へと拡張する条件が見つかれば、再生医療における多くの倫理的、道徳的、宗教的、そして法的問題が自動的に解決されることは誰もが理解している。さらに、この場合、再生幹細胞の潜在能力の源は患者の自己間質細胞となるため、細胞移植に対する免疫拒絶の問題も解決される。近い将来、これらの見通しがどれほど現実的であるかが明らかになるだろう。

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医療における間葉系幹細胞の利用

臨床において、間葉系幹細胞由来細胞は、主に広範囲かつ深部の熱傷による皮膚損傷に伴う組織欠損の修復に使用されています。前臨床段階では、同種線維芽細胞様間葉系幹細胞を用いた深部熱傷の治療可能性に関する実験的評価が行われました。骨髄線維芽細胞様間葉系幹細胞は培養時に単層を形成することが示され、移植することで深部熱傷の再生プロセスを最適化することが可能です。著者らは、胎児線維芽細胞にも同様の特性があるものの、倫理的および法的問題が存在するため、臨床応用には限界があると指摘しています。ウィスターラットを用いて、全皮膚層に損傷を伴う深部熱傷をモデル化しました。熱傷面積は全皮膚表面積の18～20%でした。最初の実験群には、深部熱傷を負ったラットと同種線維芽細胞様間葉系幹細胞の移植が含まれていました。第二群は、深部熱傷を負った動物と同種異系胎児線維芽細胞の移植を受けた動物から構成されました。第三群は、細胞療法を受けていない深部熱傷の対照群ラットです。線維芽細胞様間葉系幹細胞と胎児線維芽細胞の懸濁液を、ピペットを用いて2×10 ⁴の量を熱傷創面に塗布しました。熱傷のモデルを作成し、壊死性かさぶたを切除してから 2 日後に、細胞を移植しました。細胞移植後、熱傷の表面をゲンタマイシンを含む等張塩化ナトリウム溶液で湿らせたガーゼナプキンで覆いました。成体 Wistar ラットの大腿骨から、線維芽細胞様間葉系幹細胞株への誘導に使用する MSC を取得するために、骨髄細胞を採取しました。胚線維芽細胞は 14～17 日齢の胚の肺から採取しました。MSC を取得するための胚線維芽細胞と骨髄細胞は、CO2 インキュベーター内、湿度 95%、5% CO2 の雰囲気下で、37°C の温度でペトリ皿で予備培養しました。胚線維芽細胞は 4 ～ 6 日間培養しましたが、MSC の単層の形成には 14 ～ 17 日かかりました。その後、MSCは4日間解凍・培養することで得られた線維芽細胞様間葉系幹細胞の原料として凍結保存された。形成された線維芽細胞様間葉系幹細胞の数は、同じ培養期間中に形成された胎児線維芽細胞の数の3倍以上であった。培養段階で火傷創に移植された細胞を識別するため、大腸菌β-ガラクトシダーゼをコードする1ac-2遺伝子を含む組み換え型アデノウイルスVに基づくウイルスシャトルベクターを用いて、ゲノムを標識した。移植後様々な時点の生細胞を、特徴的な青緑色の染色を与えるX-Gal基質を添加した凍結切片で免疫組織化学的に検出した。火傷創の状態を動的視覚、面積測定、組織学的に評価した結果、細胞移植後3日目には、選択されたグループにおいて創傷過程の経過に有意な差が現れることが判明した。この違いは、細胞移植後7日目に特に顕著になりました。線維芽細胞様間葉系幹細胞を移植した第1群の動物では、創傷が均一に濃いピンク色になり、創傷面全体に肉芽組織が表皮レベルまで成長し、熱傷面積が大幅に縮小しました。創傷面に形成されたコラーゲン膜はやや薄くなりましたが、熱傷面全体を覆い続けました。胎児線維芽細胞を移植した第2群の動物では、肉芽組織が創縁の表皮レベルまで上昇しましたが、それは部分的にしか見られず、創傷からの血漿漏出は第1群よりも激しく、当初形成されたコラーゲン膜は実質的に消失しました。細胞療法を受けなかった動物では、7日目の熱傷創は、フィブリンで覆われた青白く陥凹した壊死組織でした。火傷の全面にプラズマが認められた。組織学的には、第1群と第2群の動物は細胞浸潤と血管網の発達の減少が見られた。そして、これらの初期の再生プロセスの兆候は、第1グループのラットでより顕著でした。対照群では、創傷の細胞浸潤の兆候が観察されましたが、新生血管の組織学的パターンは見られませんでした。観察15〜30日目に、第1グループの動物の熱傷面積は他のグループのラットよりも有意に小さく、肉芽表面がより発達していました。第2グループの動物では、対照群のラットの熱傷の大きさと比較して、熱傷面積も減少しており、これは辺縁上皮化により発生しました。対照群では、熱傷表面は、まれに肉芽がみられる場所で青白いままで、その上に血管の星状斑が現れ、線維素性プラークの島があり、中等度の血漿漏出が熱傷表面全体に続き、剥がれにくいかさぶたがところどころに残っていました。一般的に、第 3 グループの動物では、傷の大きさも減少しましたが、傷の端は損傷したままでした。

線維芽細胞様間葉系幹細胞および胎児線維芽細胞を用いた場合と、細胞療法を用いない場合の創傷治癒速度の比較研究において、線維芽細胞様間葉系幹細胞および胎児線維芽細胞の移植により、熱傷表面の治癒速度が加速することが確認されました。しかし、同種線維芽細胞様間葉系幹細胞を用いた場合、胎児線維芽細胞移植よりも創傷治癒速度が速くなりました。これは、再生過程の段階的変化の加速、すなわち細胞浸潤の減少、血管網の成長速度の増加、および肉芽組織の形成という形で現れました。

動的面積測定の結果、火傷創の自然治癒率（細胞療法を使用しない場合）は最も低かった。同種線維芽細胞様間葉系幹細胞移植後15日目と30日目には、創傷治癒率が胎児線維芽細胞移植時よりも高かった。β-ガラクトシダーゼを検出する組織化学法では、線維芽細胞様間葉系幹細胞と胎児線維芽細胞の移植後、移植細胞は観察期間全体を通して再生創の表面と深部で生存していることが示された。著者らは、線維芽細胞様間葉系幹細胞の使用により火傷創の再生率が高くなるのは、成熟過程でこれらの細胞から生物学的に活性な成長刺激因子が放出されるためであると考えている。

熱傷の治療には、自己または同種ケラチノサイトや同種線維芽細胞の移植も臨床現場で使用されています。広範囲の深い熱傷を負った小児の外科的治療は、外傷性が高く、多回の外科的介入、多量の失血、使用する輸液に対するさまざまな反応などにより、複雑な作業となることに留意する必要があります。体表面積の40%を超える広範囲の深い熱傷に対する皮膚形成外科手術の実施が困難な主な理由は、患者の状態の重篤さと皮膚ドナーの不足です。穿孔係数の高いメッシュ移植では、穿孔後に形成された細胞の上皮化が非常に遅く、皮膚弁自体が溶解または乾燥することが多いため、問題は解決しません。異種皮膚、死体同種移植片、合成フィルムなどの熱傷創の被覆は必ずしも効果的ではないため、培養されたケラチノサイトと線維芽細胞の層で熱傷表面を覆う新しい方法が開発されています。特に、培養された同種線維芽細胞を用いて熱傷表面を覆う方法が提案されており、移植すると、境界性熱傷の創傷内に残存する表皮細胞、およびメッシュ移植片の隔壁内のケラチノサイトの増殖を顕著に刺激する効果があります。L. Budkevichら（2000年）の研究は、この方法を小児の熱傷治療に用いた結果を示しています。この研究には、1歳から14歳までの熱傷を負った小児31名が対象となりました。 3 人の子供において、グレード IIIA-B - IV の熱傷の総面積は体表面積の 40%、25 - 50 - 70%、他の 3 人は 71 - 85% であった。早期外科的壊死切除術は培養同種線維芽細胞移植および自家真皮形成術と組み合わせられた。治療の第 1 段階は壊死組織の切除、第 2 段階はキャリア フィルム上への培養同種線維芽細胞移植、第 3 段階 (培養同種線維芽細胞移植の 48 時間後) はマトリックスの除去および穿孔率 1:4 の皮弁による自家真皮形成術であった。重度の熱傷でクリニックに入院した 3 人の患者では、培養同種線維芽細胞が肉芽形成創に移植された。培養同種線維芽細胞の移植は、18 人の子供で 1 回、11 人の子供で 2 回、2 人の患者で 3 回実施された。細胞培養で覆われた創傷面積は30～3500cm²であった。培養同種線維芽細胞の有効性は、皮膚移植の生着率、熱傷治癒時間、および重度熱傷による死亡者数によって評価された。移植片は患者の86%で完全に生着した。皮膚移植片が部分的に生着しなかった症例は14%に認められた。治療にもかかわらず、6人（19.3%）の小児が死亡した。これらの小児の皮膚損傷面積は、体表面積の40～70%に及んだ。培養された同種線維芽細胞の移植は、どの患者においても火傷による死亡率と関連していませんでした。

治療結果を分析した著者らは、体表面積の35～40％を占める深い熱傷による皮膚損傷は、以前は生存に適さないと考えられていたと指摘している（3歳までの低年齢児では体表面積の30％を占める深い熱傷が重篤で、高年齢児では体表面積の40％を超える）。培養同種線維芽細胞移植を伴う外科的壊死切除術とそれに続く高穿孔係数の皮弁による自己皮膚形成術を実施する場合、IIIB～IV度熱傷は依然として重篤だが、現在では多くの場合、このような犠牲者の命も救える見込みがある。深い熱傷を負った小児における培養同種線維芽細胞移植と自己皮膚形成術を併用した外科的壊死切除術は、ドナーサイトが不足している広範囲の皮膚病変を有する患者に特に効果的であることが証明されている。積極的外科手術と培養同種線維芽細胞の移植は、患者の全身状態の迅速な安定化、熱傷に伴う感染性合併症の減少、移植片の生着に好ましい条件の創出、失われた皮膚の回復時間と入院期間の短縮、広範囲熱傷患者の致死的転帰の頻度の減少に貢献します。したがって、培養同種線維芽細胞の移植とそれに続く皮弁を用いた自家真皮形成術は、以前は回復が不可能と考えられていた重症熱傷の小児の回復を可能にします。

火傷治療の第一の目的は、毒性作用、感染性合併症、脱水症状を防ぐために、損傷した皮膚を最も完全かつ迅速に修復することであると一般に認められています。培養細胞を用いた結果は、火傷の創傷自体が移植に適した状態にあるかどうかに大きく左右されます。外科的壊死切除後の創傷表面に培養ケラチノサイトを移植する場合、移植細胞の平均55%（面積比）が生着しますが、肉芽形成創の場合は生着率が15%に低下します。したがって、広範囲の深部皮膚火傷を効果的に治療するには、まず積極的な外科的戦術が必要です。IIIB～IV度の火傷創がある場合は、中毒を軽減し、火傷の合併症の数を減らすために、火傷表面から壊死組織を直ちに除去します。こうした戦術の使用は、火傷を負った瞬間から傷が閉じるまでの時間を短縮し、広範囲の火傷を負った患者の入院期間を短縮する鍵となり、また致命的な結果の数も大幅に減らします。

培養ケラチノサイトを用いて熱傷表面を覆うことに成功した最初の報告は、1980年代初頭に発表されました。その後、この処置は培養ケラチノサイトの層を用いて行われるようになりましたが、これらの層はほとんどの場合自己細胞から得られ、異物ケラチノサイトから得られることはほとんどありませんでした。しかし、自己ケラチノサイト移植術の技術では細胞バンクの作成が不可能であり、十分な面積のケラチノサイト移植片を作製するには3～4週間という長い時間がかかります。この期間中、感染症やその他の熱傷合併症を発症するリスクが急激に高まり、患者の入院期間が大幅に延長します。さらに、自己ケラチノサイトは肉芽形成を伴う熱傷創に移植してもほとんど定着せず、特殊な増殖培地やケラチノサイト増殖を促進する生理活性刺激剤の高コストが、臨床応用を著しく制限しています。コラーゲン形成術、凍結保存された異種皮膚の移植、様々なバイオポリマーコーティングなどのバイオテクノロジー的手法は、広範囲の浅い熱傷の治療効果を高めますが、深部熱傷の治療効果は向上しません。培養線維芽細胞で創傷表面を覆う方法は、培養細胞層の主成分としてケラチノサイトではなく線維芽細胞を使用するという点で根本的に異なります。

この方法の開発の前提条件は、小血管を取り囲む周皮細胞が、多くの成長因子を産生し、ケラチノサイトの増殖と接着に対する強力な刺激効果により創傷治癒を促進する線維芽細胞に変換できる前駆間葉系細胞であるというデータでした。培養線維芽細胞を使用して創傷面を閉じると、培養ケラチノサイトを使用する場合と比較して、この方法のいくつかの重要な利点がすぐに明らかになりました。特に、培養で線維芽細胞を取得するには、特別な栄養培地や成長刺激剤を使用する必要がないため、ケラチノサイトを取得する場合と比較して、移植のコストが10倍以上削減されます。線維芽細胞は簡単に不活性化され、その際に表面組織適合性抗原を部分的に失うため、移植片の製造とそのバンクの作成に同種細胞を使用する可能性が開かれます。クリニックで使用可能な移植片を得るのに必要な時間は、角化細胞の場合3週間から線維芽細胞の場合1～2日に短縮されました。線維芽細胞の一次培養は、自家皮膚形成術中に採取した皮膚片から細胞を培養することで得られ、ヒト線維芽細胞の継代培養を得るための細胞播種密度は1cm ^{2あたりわずか20 x 103個}です。

線維芽細胞とその調節タンパク質が角化細胞の増殖と分化に及ぼす影響を研究するため、ヒト線維芽細胞との共培養において、コラーゲンI型およびIII型、ならびにフィブロネクチンを基質とした角化細胞の形態と増殖を比較分析しました。ヒト角化細胞は、自家皮膚形成術中に採取された熱傷患者の皮膚片から分離されました。角化細胞の播種密度は1 cm²あたり50 x 103個でした。培養線維芽細胞移植の臨床効果は517人の患者で評価されました。すべての患者は2つのグループに分けられました。グループ1：IIA、B～IV度の熱傷を負った成人被害者。グループ2：IIIB～IV度の深部熱傷を負った小児。単層培養線維芽細胞の構造的および機能的組織のダイナミクスを、再生過程におけるグリコサミノグリカン、フィブロネクチン、コラーゲンの役割を考慮した評価により、著者らは線維芽細胞培養を用いて移植を行うのに最も好ましい時期として3日目を特定することができました。線維芽細胞がケラチノサイトの増殖および分化に及ぼす影響に関する研究では、in vitro線維芽細胞は、主にケラチノサイトの接着過程に顕著な刺激効果を示し、接着細胞数とそれらの固定速度を2倍以上増加させることが示されました。接着過程の刺激は、DNA合成の強度とケラチノサイトの増殖レベルの増加を伴います。さらに、線維芽細胞とそれによって形成される細胞外マトリックスの存在は、ケラチノサイトのトノフィブリル装置、細胞間結合、そして最終的にはケラチノサイトの分化と基底膜の形成に必要な条件であることが判明しました。重度の火傷を負った小児の治療において、特にドナー部位が欠損した広範囲の皮膚損傷を有する患者群において、同種線維芽細胞培養移植の高い臨床効果が確立されています。包括的な形態機能研究により、移植線維芽細胞は、細胞が形成する細胞外マトリックスの一部であるDNA、コラーゲン、フィブロネクチン、グリコサミノグリカンの活発な合成を特徴とすることが示されています。著者らは、移植線維芽細胞の高い生着率（最大96%）、移植時間の大幅な短縮（ケラチノサイトを使用する場合の2～3週間ではなく、24～48時間以内）、火傷表面の上皮化の大幅な促進、およびケラチノサイト移植と比較して線維芽細胞からの移植細胞培養技術のコストの大幅な削減（10分の1）を指摘しています。培養された同種線維芽細胞の移植を利用することで、体表面積の50%以上に熱傷を負った重篤な火傷を負った子供の命を救うことができる。これまでは生命とは相容れないと考えられていたものです。同種異系胎児線維芽細胞の移植により、様々な程度や部位の火傷を負った患者の創傷再生と回復が早まるだけでなく、死亡率も大幅に低下することが確実に証明されています。

自己線維芽細胞は、声帯損傷の再建術といった形成外科の複雑な分野にも用いられています。この目的には通常、牛由来のコラーゲンが用いられますが、その作用持続時間は免疫原性によって制限されます。牛由来のコラーゲンは異質タンパク質であるため、受容者のコラーゲナーゼに敏感で免疫反応を引き起こす可能性があります。このリスクを軽減するために、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲン製剤を製造する技術が開発されました。この技術の利点は、安定性が高く免疫原性が低いことであり、声帯の欠損や萎縮の除去に実用化されています。自己コラーゲンの注入は1995年に初めて使用されました。この技術により、分子内酵素触媒架橋を含む自己コラーゲン繊維の一次構造が確実に保持されました。実際、天然コラーゲン繊維は、テロペプチドが切断された再構成コラーゲンよりもプロテアーゼによる破壊に対して耐性があります。テロペプチドの完全性は、コラーゲン繊維の四次構造と隣接するコラーゲン分子間の架橋形成に重要です。ウシコラーゲン製剤とは異なり、自家コラーゲンはレシピエントに免疫反応を引き起こさないものの、補充剤としては十分な効果がありません。自家線維芽細胞移植による局所的なコラーゲン産生により、安定した修復が達成できます。しかし、臨床における自家線維芽細胞移植の有効性に関する研究において、いくつかの困難が明らかになりました。線維芽細胞移植後の初期段階における臨床効果は、ウシコラーゲン導入後と比較して弱いものでした。自家線維芽細胞を培養する場合、線維芽細胞とコラーゲン原線維の特異的な相互作用によって引き起こされるコラーゲンゲルの収縮によって証明されるように、線維化と瘢痕形成の原因となる病的な線維芽細胞、いわゆる筋線維芽細胞への正常な線維芽細胞の変化の可能性を排除することはできません。さらに、in vitro で連続的に継代培養すると、線維芽細胞は細胞外マトリックスタンパク質を合成する能力を失います。

しかし、現在では、上記の欠点を解消し、正常線維芽細胞の癌化を引き起こさない、自家ヒト線維芽細胞の培養法が実験的に開発されている。この方法で得られた自家線維芽細胞は、顔面の軟部組織の欠損を修復するために使用される。G. Keller ら (2000) の研究では、しわや萎縮性瘢痕のある 37 歳から 61 歳の患者 20 名が治療された。耳介後部からの皮膚生検 (4 mm) が、10 ml の培養培地 (抗生物質、真菌性敗血症薬、ピルビン酸、およびウシ胎児血清を含むイーグル培地) を含む滅菌試験管で研究室に運ばれた。材料は直径 60 mm の培養皿 3～5 枚に入れ、5% CO2 を含む雰囲気のサーモスタットでインキュベートされた。 1週間後、細胞をトリプシン処理でシャーレから取り出し、25 cm2のバイアルに入れました。細胞を4 x 107個ずつ患者に注入しました。鼻唇溝の矯正中の患者と、3回目の自家線維芽細胞の移植から7か月後および12か月後に瘢痕のある患者で、有意で持続的な臨床効果が観察されました。フローサイトメトリーによると、培養された線維芽細胞は大量のI型コラーゲンを産生しました。in vitro研究では、注入された線維芽細胞の収縮性が正常であることが示されています。培養線維芽細胞を4 x 107個ずつ皮下投与してから2か月後、ヌードマウスに腫瘍は検出されませんでした。注入された線維芽細胞は、患者に瘢痕やびまん性線維症を引き起こしませんでした。著者によると、移植された自家線維芽細胞はコラーゲンを持続的に生成することができ、美容上の若返り効果をもたらすとのことです。同時に、分化細胞の寿命には限りがあるため、若い患者から採取した線維芽細胞は高齢者から採取したものよりも効果的です。将来的には、若いドナーから採取した線維芽細胞の培養物を凍結保存し、後に彼自身の若い細胞を高齢患者に移植することが可能になると予想されています。結論として、機能が保存されている限り、自己線維芽細胞が顔面軟部組織の欠損を矯正するための理想的な手段であると結論付けることは完全に正しいとは言えません。同時に、著者自身も、研究中に自己線維芽細胞-コラーゲンシステムの使用に関連するいくつかの問題が生じたことを指摘しています。臨床効果は牛コラーゲンを使用した場合よりも弱いことが多く、患者の失望を招きました。

概して、間葉系幹細胞の臨床応用の見通しに関する文献データは非常に楽観的です。自己骨髄由来多能性間葉系前駆細胞を用いて変形性関節症を治療する試みが行われています。複雑骨折の治療における培養間葉系前駆細胞の使用に関する初の臨床試験が実施されています。自己および同種間葉系骨髄間質細胞は、外傷または自己免疫病変による関節軟骨欠損の修復において、移植用軟骨組織を作成するために使用されます。I型コラーゲン遺伝子の変異によって引き起こされる重度の不完全骨形成を有する小児の骨欠損を解消するために、多能性間葉系前駆細胞の臨床応用のための方法が開発されています。骨髄除去術後、レシピエントの子供にはHLA適合の健康なドナーからの骨髄が移植されます。これは、未分画骨髄には重度の骨欠損を補うのに十分な数の間葉系幹細胞が含まれている可能性があるためです。同種骨髄移植後、このような子供では海綿骨の組織学的変化が良好で、成長率が増加し、骨折の発生率が低下しています。場合によっては、近縁の同種骨髄と骨芽細胞を移植することで良好な臨床結果が得られます。MSC移植は、骨組織内の骨芽細胞と破骨細胞の不均衡によって引き起こされる先天性の骨脆弱性の治療にも使用されます。この場合、患者の骨組織内の幹細胞と前駆間質細胞のプールのキメラ化を通じて骨形成の回復が達成されます。

間質組織の遺伝子欠陥の修正を目的としたドナー間葉系幹細胞の遺伝子改変法の改善が続けられています。近い将来、間葉系前駆細胞は神経学において、脳細胞の標的キメラ化や、疾患の臨床症状の原因となる欠損酵素または因子を生成できる健康な細胞プールの作成に使用されると予想されています。間葉系幹細胞の移植は、放射線療法および化学療法後の癌患者の骨髄間質の修復に使用でき、骨髄細胞と組み合わせて造血の修復にも使用できます。MSCの助けを借りて筋骨格系の欠陥を除去することを目的とした補充療法の開発は、間葉系幹細胞の子孫が生息するフレームワークを形成するマトリックス生体材料または生体模倣物の設計分野における工学開発によって促進されています。

間葉系幹細胞の供給源

間葉系幹細胞の主な供給源は骨髄であり、哺乳類の体内の造血幹細胞は血液細胞と免疫系細胞へと絶えず分化します。一方、間葉系幹細胞は骨髄間質に存在する線維芽細胞様細胞の小集団として代表され、造血幹細胞の未分化状態の維持に寄与します。特定の条件下では、間葉系幹細胞は軟骨細胞と骨組織細胞へと分化します。低密度播種条件下で培養培地に播種すると、骨髄の単核間質細胞は接着細胞のコロニーを形成します。これらの接着細胞は、実際には線維芽細胞様の多能性間葉系前駆細胞です。一部の研究者は、分化に関与していない間葉系幹細胞が骨髄に蓄積され、自己複製能と高い分化能により、哺乳類の生涯を通じて体全体の組織に間質性要素の間葉系前駆細胞を提供すると考えています。

骨髄では、間質細胞要素が類洞と骨組織の間の空間を埋めるネットワークを形成しています。成人の骨髄における休眠中のMSC（間葉系幹細胞）の含有量は造血幹細胞の量に匹敵し、0.01～0.001%を超えません。骨髄から単離され培養されていない間葉系幹細胞は、接着分子を欠いています。このようなMSCは、CD34、ICAM、VCAM、I型およびIII型コラーゲン、CD44、CD29を発現しません。したがって、in vitroでは、培養基質上に固定されるのは間葉系幹細胞ではなく、細胞骨格の構成要素と細胞接着分子の受容体装置を既に形成している、より発達した間葉系幹細胞の分化前駆細胞です。CD34表現型を持つ間質細胞は末梢血中にも存在しますが、骨髄中ではCD34陽性単核細胞よりも著しく少ないです。血液から分離され培養された CD34 細胞は基質に付着し、線維芽細胞様細胞のコロニーを形成します。

哺乳類およびヒトの胚期において、すべての臓器および組織の間質基盤は、器官形成前およびその段階において、共通の間葉系幹細胞プールから発生することが知られています。したがって、成熟した生物では、間葉系幹細胞の大部分は結合組織および骨組織に存在すると考えられています。疎性結合組織および骨組織の間質の細胞要素の主要部分は、分化前駆細胞によって代表されることが確立されていますが、これらの細胞はin vitroで増殖およびクローン形成する能力を保持しています。このような細胞が全身の血流に導入されると、20%を超える間葉系前駆細胞が造血組織および実質器官の間質要素に移植されます。

間葉系幹細胞の潜在的な供給源の一つとして脂肪組織が挙げられますが、この幹細胞の中には、様々な程度に分化誘導された脂肪細胞前駆細胞が同定されています。脂肪組織の最も未成熟な前駆細胞は間質血管細胞であり、骨髄の多能性間葉系前駆細胞と同様に、グルココルチコイド、インスリン様成長因子、およびインスリンの影響下で脂肪細胞へ分化することが可能な能力を有しています。培養下では、間質血管細胞は脂肪細胞と軟骨細胞へ分化し、骨髄由来の脂肪組織中には脂肪細胞と骨芽細胞を形成する細胞が存在します。

間質幹細胞は筋肉にも存在することが確認されています。ヒト骨格筋から単離した細胞の一次培養では、星細胞と多核筋管が検出されます。ウマ血清存在下では、星細胞は細胞分化の兆候を示さずにin vitroで増殖し、栄養培地にデキサメタゾンを添加すると、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨、軟骨、脂肪組織の表現型を持つ細胞要素の出現を特徴とする分化が見られます。したがって、ヒトの筋肉組織には、分化誘導された多能性間葉系前駆細胞と誘導されていない多能性間葉系前駆細胞の両方が存在します。骨格筋に存在する前駆細胞集団は、骨髄の誘導されていない多能性間葉系前駆細胞に由来し、筋原性サテライト細胞とは異なることが示されています。

新生ラットの心筋には、分化能を有する多能性間葉系前駆細胞に相当する接着性星細胞も存在し、デキサメタゾンの影響下で脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、骨格筋ミオチューブ、心筋細胞へと分化することが確認されている。血管平滑筋細胞（周皮細胞）は、未分化な血管周囲多能性間葉系前駆細胞の分化細胞であることが示された。培養された血管周囲間葉系幹細胞は、平滑筋αアクチンおよび血小板由来増殖因子受容体を発現し、少なくとも平滑筋細胞への分化能を有する。

幹細胞の蓄積という観点から、軟骨組織は特別な位置を占めています。その修復能が極めて低いのは、多能性間葉系前駆細胞、あるいは分化因子および成長因子の欠乏に起因すると考えられています。軟骨および骨形成に分化誘導された多能性間葉系前駆細胞が、他の組織源から軟骨組織に侵入すると考えられています。

腱における間葉系前駆細胞の組織起源と分化条件も未だ解明されていない。実験的観察によれば、ウサギのアキレス腱細胞は生後初期には初代培養および継代培養においてI型コラーゲンとデコリンの発現を維持するものの、培養が進むにつれて腱細胞の分化マーカーが失われることが示唆されている。

さまざまな組織に局在する多能性間葉系前駆細胞が実際には間質内に常に存在しているのか、あるいは間葉系幹細胞の組織プールが骨髄間質幹細胞の移動によって補充されているのかという疑問に対する答えはまだ得られていないことに留意すべきである。

成体生物の骨髄やその他の間葉系組織領域に加えて、臍帯血もMSCの供給源となり得ます。臍帯静脈血には、多能性間葉系前駆細胞と同様の形態学的・抗原的特性を持ち、接着能を有し、分化能において骨髄由来の多能性間葉系前駆細胞に劣らない細胞が含まれていることが示されています。臍帯血間葉系幹細胞の培養では、5～10%の分化誘導されていない多能性間葉系前駆細胞が検出されました。臍帯血中のそれらの数は妊娠期間に反比例することが判明しており、これは胎児発育中に多能性間葉系前駆細胞が様々な組織へ移動していることを間接的に示唆しています。臍帯血から分離された間葉系幹細胞、および胎児生体材料から得られた間葉系幹細胞の臨床使用に関する最初の情報が出てきました。これは、胎児幹細胞が成人の受容者の臓器や組織系に統合、移植され、機能するという既知の能力に基づいています。

間葉系幹細胞の新たな供給源の探索

胚由来の間葉系幹細胞、そして他の胎児細胞の使用は、多くの倫理的、法的、司法的、立法的な問題を引き起こします。そのため、胚体外ドナー細胞材料の探索は続いています。ヒト皮膚線維芽細胞の臨床応用への試みは失敗に終わりました。これは、この技術の経済的可能性の高さだけでなく、線維芽細胞が線維細胞へと急速に分化してしまうこと、そして線維細胞は増殖能が著しく低く、産生する成長因子の数も限られていることが、事前に予測されていたためです。MSCおよび骨髄の多能性間葉系前駆細胞の生物学研究のさらなる進歩により、自己間葉系幹細胞の臨床応用戦略を開発することができました。それらの分離、培養、体外複製、そして標的分化の技術には、まずMSCの分子マーカースペクトルの研究が必要でした。解析の結果、ヒト骨組織の一次培養には、多能性間葉系前駆細胞が複数種類含まれていることが示された。間質前駆細胞のマーカーSTRO-1を発現するが、骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼを発現しない細胞において、前骨芽細胞の表現型が検出された。このような細胞は、石灰化骨基質の形成能力が低く、オステオポンチンおよび副甲状腺ホルモン受容体の発現がないという特徴がある。アルカリホスファターゼを発現しないSTRO-1陽性細胞の派生体は、中間分化および完全分化骨芽細胞として代表される。クローン化されたSTRO-1陽性ヒト海綿骨細胞の細胞成分は、成熟した骨細胞および脂肪細胞へ分化できることが明らかになった。これらの細胞の分化の方向は、多価不飽和脂肪酸、炎症誘発性サイトカインである IL-1β および腫瘍壊死因子α (TNF-α)、ならびに抗炎症性および免疫抑制性の TGF-β の効果によって決まります。

その後、多能性間葉系前駆細胞は、それらに固有の特定の表現型を欠いているが、造血細胞の免疫表現型抗原であるCD45、CD34、およびCD14の発現がない状態で、間葉系、内皮系、上皮系、および筋細胞に特徴的なマーカーの複合体を発現することが判明しました。さらに、間葉系幹細胞は、造血および非造血成長因子、インターロイキンおよびケモカインを恒常的かつ誘導的に産生し、一部のサイトカインおよび成長因子の受容体が多能性間葉系前駆細胞上に発現しています。5-フルオロウラシル未処理の多能性間葉系前駆細胞の抗原プロファイルとほぼ同じ免疫表現型を持つ休眠細胞が、人体の間質マトリックスの細胞の中に見つかっており、どちらの細胞も「成体」幹細胞を示すCD117を発現しています。

したがって、間葉系幹細胞に固有の細胞マーカーはまだ特定されていません。静止細胞は、骨形成（Cbfa-1）または脂肪形成（PPAR-y-2）にコミットした細胞のマーカーを発現していないため、分化にコミットしていない多能性間葉系前駆細胞の集団を表していると考えられています。ゆっくりと増殖する静止細胞をウシ胎児血清に長期間さらすと、急速な成長を特徴とする、最終分化にコミットした前駆細胞が形成されます。このような間葉系幹細胞のクローン増殖はFGF2によってサポートされています。間質性幹細胞のゲノムは非常にしっかりと「閉じている」ようです。MSCには自発的な分化がないという報告があり、特別なコミット条件がなければ、間葉系細胞にさえ分化しません。

間葉系幹細胞由来細胞の集団構造を研究するため、間質細胞株および初代培養において分化マーカータンパク質の探索が行われている。骨髄コロニー形成細胞のin vitroクローン解析により、初代培養にEGFを添加すると平均コロニーサイズが増加し、アルカリホスファターゼのクローン発現が減少する一方、ヒドロコルチゾンの添加はMSC分化の骨形成方向のマーカーであるアルカリホスファターゼの発現を活性化することが示された。STRO-1に対するモノクローナル抗体を用いることで、デクスター培養の異種システムにおいてSTRO-1陽性接着細胞集団を分離し、研究することが可能になった。造血細胞およびリンパ球細胞の増殖と分化を制御するだけでなく、傍分泌、自己分泌、内分泌機構を介して骨格組織の形成、形成、吸収にも関与する一連のサイトカインが特定されている。 cAMP、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、Ca2+などの二次メッセンジャーの受容体を介した放出は、対応する受容体を発現する様々なカテゴリーの間質組織細胞のマーカー分析にも用いられます。モノクローナル抗体をマーカーとして用いることで、リンパ器官の間質の網状細胞がT細胞依存領域とB細胞依存領域に属することを確立することが可能になりました。

造血幹細胞由来のMSC（間葉系幹細胞）の可能性については、長らく科学的議論が続いてきました。実際、骨髄細胞懸濁液を単層培養に移植すると、線維芽細胞のコロニーが個別に増殖します。しかし、骨髄中に線維芽細胞コロニーの前駆細胞や造血組織分化の様々な芽が存在することは、それらが造血幹細胞に共通して由来することを示す証拠にはならないことが示されました。骨髄幹細胞の判別分析を用いた結果、異所性骨髄移植における微小環境は造血細胞によって移行されないことが証明され、これは骨髄中に造血細胞とは組織学的に独立したMSC集団が存在することを証明しています。

さらに、選択的クローニング法によって、骨髄細胞の単層培養において新しいカテゴリーの間質前駆細胞を同定し、その数を測定し、その特性、増殖能および分化能を研究することが可能になった。間質線維芽細胞様細胞は体外で増殖して二倍体コロニーを形成し、これを体内に戻すと新しい造血器官の形成につながることが判明した。個々のクローンの研究結果は、間質前駆細胞の中に、増殖能および分化能によって間質組織の幹細胞の役割を担うことができ、組織学的には造血幹細胞とは独立している細胞集団が存在することを示している。この集団の細胞は自立的な成長を特徴とし、骨、軟骨、骨髄の網状組織の前駆細胞要素へと分化する。

R. Chailakhyanら（1997～2001年）の研究成果は非常に興味深い。彼らはウサギ、モルモット、マウスの骨髄間質前駆細胞を、ウシ胎児血清を添加したα-MEM栄養培地で培養した。著者らは、1cm²あたり2～4 x 103個の骨髄細胞の初期密度で外植を行った。同種または異種の放射線不活化骨髄細胞を、フィーダー効果を維持しながら増殖を完全に阻害する線量でフィーダーとして使用した。2週齢の線維芽細胞の一次コロニーをトリプシン処理し、モノクローナル株を取得した。コロニーのクローン起源の証拠は、オスとメスのモルモットの混合骨髄培養における染色体マーカー、生きた培養のタイムラプス写真、およびCBAマウスとCBAT6T6マウスの同系骨髄の混合培養を用いて得られた。新鮮に単離した骨髄細胞懸濁液またはin vitroで増殖させた間質線維芽細胞の腎被膜下への移植は、イバロンまたはゼラチン多孔質足場、および不活化ウサギ海綿状骨マトリックスで行われた。骨鞘へのクローン移植のために、モルモットの大腿骨から軟部組織と骨膜を取り除き、骨端線を整え、骨髄を徹底的に洗浄した。骨を断片（3-5 mm）に切断し、乾燥させ、60 Gyの線量で照射した。線維芽細胞の個々のコロニーを骨鞘に入れ、筋肉内に移植した。体外培養した間質線維芽細胞の腹腔内移植には、A 型（V=0.015 cm3、h=0.1 mm）および O 型（V=0.15 cm3、h=2 mm）の拡散チャンバーを使用しました。

R. Chailakhyanら（2001）は、クローン株の増殖動態を研究した結果、線維芽細胞コロニーを形成する個々の細胞とその子孫が、非常に大きな増殖能を持つことを発見しました。10回目の継代培養では、一部の株の線維芽細胞数は1.2～7.2 x 10 ⁹個に達しました。これらの細胞は、発育中に最大31～34回の細胞倍加を行いました。この症例では、数十個のクローンの間質前駆細胞から形成された骨髄由来株の異所性移植により、骨髄微小環境が移植され、移植部位に新たな造血器官が形成されました。著者らは、個々のクローンが間質細胞の骨髄微小環境を移植できるのか、それとも複数の異なるクローン形成性間質前駆細胞の協力が必要なのかという疑問を提起しました。また、個々のクローンが微小環境を移植できる場合、3 つの造血幹細胞芽すべてに対して完全なものになるのでしょうか、それとも、異なるクローンが異なる造血幹細胞芽に対して微小環境の形成を提供するのでしょうか。これらの問題を解決するために、コラーゲンゲル上で間質性前駆細胞を培養し、成長した線維芽細胞のコロニーを表面から剥離して異所性移植できるようにする技術が開発されました。CBA マウスおよびモルモットの骨髄細胞から増殖した間質性線維芽細胞の個々のクローンをゲルコーティングの断片とともに切除し、同系マウスの腎被膜下または自家モルモットの腹筋に異所性移植しました。筋肉に移植する際、ゲル上のコロニーは骨鞘内に配置しました。

著者らは、骨髄線維芽細胞コロニーの移植後50～90日で、症例の20％で移植領域に骨または骨および造血組織の発達が観察されたことを発見した。レシピエント動物の5％では、形成された骨組織の病巣に骨髄で満たされた空洞が含まれていた。骨シリンダーの内側では、このような病巣は丸い形をしており、骨細胞と十分に発達した骨芽細胞層を含む骨組織で作られたカプセルがあった。骨髄空洞には骨髄細胞と赤血球系細胞を含む網状組織が含まれており、その比率は正常骨髄と変わらなかった。腎臓では、移植片は生来の骨髄の移植中に形成された典型的な骨髄器官であり、骨被膜は腎被膜側からのみ骨髄空洞を覆っていた。造血組織には、骨髄系、赤血球系、巨核球系の要素が含まれていた。骨髄腔の間質にはよく発達した洞系があり、典型的な脂肪細胞が含まれていました。同時に、腎被膜下のいくつかのコロニーの移植領域に、造血の兆候のない骨組織が見つかりました。個々のクローンの増殖および分化能の研究は、ウサギのモノクローナル骨髄株で続けられました。その細胞は栄養培地に再懸濁され、1〜2 mgの質量を持つ別のイバロンスポンジで、ウサギ骨髄ドナーの腎被膜下に移植されました。21のモノクローナル株の細胞がこのような自家移植にかけられました。結果は2〜3か月後に考慮されました。著者らは、症例の14％で、移植されたモノクローナル株が骨組織と造血細胞で満たされた骨髄腔からなる骨髄器官を形成したことを発見しました。症例の 33 % で、移植された株は、空洞内に固定された骨細胞と発達した骨芽細胞層を伴う様々なサイズの緻密骨を形成しました。一部の症例では、クローンを移植したスポンジで骨や造血要素のない網状組織が発生しました。よく発達した類洞ネットワークを持つ網状間質が形成されることもありましたが、造血細胞は存在しませんでした。したがって、得られた結果は、コラーゲンゲル上でのクローン移植中に得られたデータと同様でした。ただし、基質上で成長したクローンの移植では、5 % の症例で骨髄組織、15 % の症例で骨組織、80 % の症例で網状組織が形成されたのに対し、モノクローナル株の移植では、14 % の症例で骨髄要素、53 % の症例で骨組織、53 % の症例で網状組織の形成が観察されました。著者らによると、これは、多孔質スキャフォールドへの移植中の間質線維芽細胞の増殖および分化能の実現条件が、骨鞘およびコラーゲン基質への移植中よりも最適であったことを示している。クローンの培養や逆移植といったより高度な方法を用いることで、クローンによる分化能の実現条件を改善し、これらの比率を変化させることができる可能性があります。いずれにせよ、実施された研究の主な意義は、一部の間質細胞クローンが骨組織を形成する能力を持ち、同時に赤血球系、骨髄系、巨核球系の3つの骨髄造血芽球のための間質性造血微小環境を提供し、非常に大規模な造血組織プラットフォームとある程度の骨量を形成することです。

次に著者らは、個々のクローン形成性間質前駆細胞が閉鎖系拡散チャンバー内でこれらの細胞分化を起こす能力という問題に取り組んだ。さらに、個々のクローンが多分化能を有するのか、あるいは分化能の発現には、一定の細胞分化特性を持つ複数のクローンの協同的な相互作用が必要なのか、そしてそれらの比率の違いが骨、網状組織、または軟骨組織の優先的な形成を決定するのかを明らかにする必要があった。R. Chailakhyanら（2001）は、骨髄間質前駆細胞のモノクローナル株を取得し、それを拡散チャンバーに移植するという2つの方法論的アプローチを組み合わせることで、骨髄間質の構造的組織化の理解に近づく結果を得た。 O型チャンバーに間質前駆細胞のモノクローナル株を移植したところ、骨組織と軟骨組織の両方が形成されました。これは、単一の間質コロニー形成細胞の子孫が骨組織と軟骨組織を同時に形成する能力があることを示しています。骨組織と軟骨組織が共通の間質前駆細胞に由来するという仮説は、これまで繰り返し提唱されてきました。しかし、この仮説は実験的に正しく裏付けられていませんでした。拡散チャンバー内での骨と軟骨の形成は、骨髄間質幹細胞の中に、これら2種類の組織に共通の前駆細胞が存在することの必須の証拠でした。

次に、ウサギ骨髄の一次培養から得られた第2～3継代のクローン株29株を拡散チャンバーに入れ、相同動物の腹腔内に移植した。研究により、骨髄モノクローナル株の45％に骨形成能があることが示された。9つのチャンバーには網状組織のみが含まれていたが、骨および軟骨組織とともに13のチャンバーにも網状組織が存在し、全株の76％を占めた。骨組織と軟骨組織の両方の分化が可能なO型チャンバーでは、16株が研究された。4つのチャンバー（25％）では、骨組織と軟骨組織の両方が形成された。R. Chailakhyanら（2001）の研究では、個々の前駆細胞が細胞株内で31～34回の倍加を経て、その子孫が0.9～2.0 x 10 ^9個の細胞で構成されていたことに再度留意する必要がある。ポリクローナル株の祖細胞が経た有糸分裂の数は、モノクローナル株のものと実質的に同一であった。ポリクローナル株の発達速度、特に形成の初期段階は、株を開始するために使用されたコロニーの数に大きく依存した。ヒト胎児線維芽細胞の二倍体株 (WI-38) は、12～15 回目の倍加レベルで再クローン化された場合、直径と細胞含有量が異なるコロニーも形成した。103 個を超える細胞を含む大きなコロニーは、わずか 5～10% を占めた。分裂回数が増えるにつれて、大きなコロニーの割合は減少した。骨髄間質線維芽細胞のモノクローナルおよびポリクローナル株は、20 回以上の倍加後も二倍体の染色体セットを保持し、その発達の傾向は胎児線維芽細胞の二倍体株の発達のダイナミクスに匹敵した。モノクローナル株を拡散チャンバーに移植して個々の骨髄間質前駆細胞の分化能を解析した結果、その半数は骨芽細胞であることが示された。大きなコロニーは総数の10%を占めていた。したがって、骨芽細胞コロニーを形成する細胞の数は、総細胞数の約5%に相当する。著者らが同定した骨芽細胞前駆細胞の総量には、骨組織と軟骨組織を同時に形成できる細胞が含まれていた。さらに、成体生物におけるこれら2種類の組織には共通の前駆細胞が存在することが初めて確認された。検査したクローンの25%はこのような細胞によって作製され、前駆細胞総数に占めるその数は少なくとも2.5%であった。

このように、骨髄線維芽細胞の個々のクローンの異所性移植により、間葉系前駆細胞集団の構造的組織化の新たな側面が明らかになりました。すべての造血芽に特定の微小環境を一度に移行させることができる間質性前駆細胞が発見されました。さまざまなモデルで研究された大きなクローンのうち、その数は5～15％（検出された前駆細胞の総数の0.5～1.5％）です。完全な骨髄微小環境を移行するクローンに加えて、骨形成のみを目的とした前駆細胞があり、これを開放系で移植すると、造血の発達をサポートしない骨組織を形成します。前駆細胞の総数に占めるその数は1.5～3％です。これらの細胞の中には、限られた期間の自己維持で骨組織を形成できるものがあります。その結果、間質前駆細胞集団は分化能において異質性を示す。その中には、骨髄間質組織に特徴的な3方向すべてへの分化能を有し、骨、軟骨、網状組織を形成する間質幹細胞を自称する細胞群が存在する。提示されたデータから、様々な細胞マーカーを用いることで、デクスター培養において、各タイプの間質細胞が特定の微小環境の構築と造血維持にどのように寄与しているかを明らかにすることが可能になることを期待できる。

間葉系幹細胞の特徴

近年、静止した骨髄培養において、多能性間葉系前駆細胞は、コロニー形成能が低く、増殖細胞に特異的なKi-67抗原を発現しないことを特徴とする小型無顆粒細胞（RS-1細胞）の限られた集団で表されることが確立されている。休眠中のRS-1細胞の抗原パラメータは、急速に増殖するコミット間質前駆細胞の抗原スペクトルとは異なる。コミット前駆細胞の高い増殖率は、RS-1細胞の存在下でのみ観察されることが確立されている。次に、RS-1細胞は、多能性間葉系前駆細胞の最も成熟した誘導体によって分泌される因子の影響を受けて増殖速度を増加させる。RS-1細胞は、リサイクル可能な非コミットMSCのサブクラスであると思われる。試験管内で、5-フルオロウラシル耐性骨髄間質前駆細胞は、RNA含有量が低く、非増殖細胞のマーカーであるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現が高いという特徴があります。

間質性前駆細胞は、基質への固定後、活発な増殖を開始します。この場合、低分化細胞のマーカープロファイルが発現します：SH2（TGF-β受容体）、SH3（シグナル伝達タンパク質ドメイン）、I型およびIII型コラーゲン、フィブロネクチン、接着受容体VCAM-1（CD106）およびICAM（CD54）、カドヘリン11、CD44、CD71（トランスフェリン受容体）、CD90、CD120a、およびCD124。ただし、造血幹細胞の特徴的なマーカー（CD34、CD14、CD45）は発現しません。クローン増殖により、間葉系幹細胞を繰り返し継代培養することが可能になり、培養中に多数の遺伝的に均質な間質性前駆多能性細胞が形成されます。2～3回の継代培養後、その数は5,000万～3億個に達します。十分な密度で培養された細胞では、増殖が停止した後、造血組織線維芽細胞とは異なり、間質前駆細胞は脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞へと分化します。1-メチルイソブチルキサンチン（細胞内cAMP形成の誘導剤）、デキサメタゾン（ホスホリパーゼAおよびCの阻害剤）、インドメタシン（シクロオキシゲナーゼの阻害剤であり、トロンボキサン合成酵素の活性も低下させる）を含む3つの調節分化シグナルを組み合わせることで、最大95%の前駆間葉系細胞が脂肪細胞に変換されます。未熟な間質要素からの脂肪細胞の形成は、リポタンパク質リパーゼ遺伝子の発現、アポリポタンパク質およびペルオキシソーム受容体の組織化学的検出によって確認されます。無血清培地中でTGF-βの影響下にある同じクローンの細胞は、均質な軟骨細胞集団を形成します。この軟骨組織の多層細胞培養は、プロテオグリカンとII型コラーゲンからなる発達した細胞間マトリックスを特徴としています。10%の栄養培地中で、間質前駆細胞を同じ培養液中で培養すると、β-グリセロリン酸（無機リン酸供与体）、アスコルビン酸、デキサメタゾンからなる分化シグナル複合体の作用により細胞凝集体が形成されます。このような細胞では、アルカリホスファターゼ活性とオステオポンチンレベルの漸進的な増加が観察され、これは骨組織の形成を示唆しています。細胞の石灰化は、細胞内カルシウム含量の漸進的な増加によって確認されます。

いくつかのデータによると、間葉系幹細胞は、様々な種類の間葉系分化細胞株を無制限に分裂・増殖させる能力と、高い可塑性を兼ね備えています。脳室または白質に導入された間葉系幹細胞は、神経組織の実質へと移行し、グリア細胞株またはニューロン細胞株の派生細胞へと分化します。さらに、in vitroおよびin vivoの両方において、MSCから造血幹細胞への分化転換に関する情報も得られています。いくつかの研究におけるより詳細な分析により、MSCの非常に高い可塑性が確認されており、これはアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ニューロン、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞への分化能力に表れています。体外および体内での MSC の分化転換能に関する多数の研究により、骨髄由来の多能性間葉系前駆細胞が最終的に骨、軟骨、筋肉、神経、脂肪組織、さらには造血をサポートする腱や間質を形成する細胞株に分化することが明らかになっています。

しかし、他の研究では、間葉系幹細胞ゲノムと間質細胞の祖細胞集団の多能性の制限の兆候は明らかにされなかったが、1つの一次培養から分離された200を超えるMSCのクローンが間質細胞の多能性の可能性をテストするために研究された。in vitroクローンの圧倒的多数は、骨形成、軟骨形成、および脂肪形成方向への分化能力を保持していた。腎被膜下または拡散チャンバー内での間葉系幹細胞の移植により受容体細胞の移動の可能性を排除すると、in situの間質祖細胞は異質な表現型を保持していることが判明し、これは移植領域に制限因子が存在しない、またはMSCの多能性自体が存在しないことを示唆している。同時に、すべての成体幹細胞の共通の前駆細胞である体性多能性幹細胞のまれなタイプの存在が認められる。

真性間葉系幹細胞は骨髄細胞のごく一部を占め、in vitro 培養中に特定の条件下で分化することなく増殖することができるが、その多分化能は多能性ではない。このことは、骨、軟骨、脂肪、筋肉組織の細胞、ならびに造血をサポートする腱細胞および間質要素への誘導されたコミットメントによって証明されている。通常、ウシ胎児血清を含む培養液に長時間さらすと、MSC がコミットされた間質性前駆細胞に放出され、その子孫は自発的に最終分化を受ける。in vitro では、調整培地にデキサメタゾン、β-グリセロリン酸、およびアスコルビン酸を添加することで骨芽細胞の標的形成を達成することができ、一方、デキサメタゾンとインスリン分化シグナルの組み合わせは脂肪細胞の形成を誘導する。

骨髄MSCは、最終分化の段階に入る前に、特定の培養条件下で線維芽細胞様間葉系幹細胞にまず分化することが確立されています。これらの細胞の生体内派生物は、骨、軟骨、腱、脂肪組織および筋肉組織、ならびに造血を支える間質の形成に関与しています。多くの著者は、「多能性間葉系前駆細胞」という用語を、MSC自体と、骨髄および間葉系組織の分化間質前駆細胞の両方を意味すると理解しています。骨髄由来の多能性間葉系前駆細胞のクローン解析により、全クローンの3分の1強が骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化し、残りのクローンの細胞は骨形成能のみを持ち、軟骨細胞と骨細胞のみを形成することが示されました。 BMC-9などの多能性間葉系前駆細胞のクローンは、適切な微小環境条件下で、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞だけでなく、造血を支える間質細胞の表現型と機能特性を持つ細胞へと分化します。ラット胎児骨髄から単離されたRCJ3.1細胞のクローンは、様々な表現型の間葉系細胞へと分化します。アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾンの複合作用下で、このクローンの細胞成分はまず多核心筋細胞を形成し、その後、脂肪細胞、軟骨細胞、そして石灰化骨組織の島へと順次分化します。ラット胎児の骨膜からの顆粒細胞集団は、増殖率が低く、分化マーカーを発現せず、培養条件下で軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、および平滑筋細胞に分化するため、未分化多能性間葉系前駆細胞に相当します。

したがって、間葉系幹細胞のゲノムの多能性または多分化能の問題は未解決のままであり、したがって、間質性前駆細胞の分化能についての考えにも影響を及ぼし、これも明確に確立されていないことを認識する必要があります。

間葉系幹細胞の実験的に証明された重要な特性は、組織ニッチを離れ、全身の血流中を循環する能力です。遺伝的分化プログラムを活性化するには、このような循環幹細胞が適切な微小環境に入る必要があります。MSCを受容体動物の血流に系統的に導入すると、未成熟細胞が様々な臓器や組織に移植され、血液細胞、筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞へと分化することが示されています。その結果、局所組織領域において、分化前および分化後の間質性前駆細胞間、そしてそれらと周囲の成熟細胞間でシグナル調節的な相互作用が生じます。分化は、間葉系および非間葉系由来の傍分泌制御因子（成長因子、エイコサノイド、細胞外マトリックス分子）によって誘導され、多能性間葉系前駆細胞の微小環境において空間的および時間的なつながりを形成すると考えられています。したがって、間葉系組織の局所的損傷は、多能性間葉系前駆細胞の微小環境において、健常組織の制御シグナル複合体とは質的に異なる領域の形成につながるはずであり、そこでは修復的再生プロセスではなく生理的再生プロセスが進行する。この違いは、正常微小環境と損傷誘発微小環境における細胞表現型の特化という観点から極めて重要である。

これらの概念によれば、ここに、既知の2つのプロセス、すなわち生理的再生と炎症性増殖の根本的な違いのメカニズムが埋め込まれている。前者は組織の特殊な細胞構成とその機能の回復で終わるのに対し、増殖プロセスの実行の結果は、成熟した結合組織要素の形成と損傷した組織領域の機能喪失である。したがって、再生医療における多能性間葉系前駆細胞の利用に最適なプログラムを開発するには、微小環境因子がMSCの分化に及ぼす影響の特性を徹底的に研究する必要がある。

幹細胞コンパートメントの構造が、細胞外シグナルによって発現が調節される細胞傍分泌および自己分泌調節因子に依存していることは疑いようがありません。調節因子の機能の中で最も重要なのは、MSCの非対称分裂の制御と、分化段階および細胞分裂回数を決定する遺伝子の発現です。MSCのさらなる発達を左右する外部シグナルは、微小環境によって提供されます。未成熟状態のMSCは、脂肪細胞、筋線維芽細胞、造血組織間質、軟骨細胞、骨細胞へと分化する能力を維持しながら、長期間増殖します。血液中を循環するCD34陰性間質細胞成分の限られた集団が、全身血流から骨髄間質に戻り、そこでCD34陽性造血幹細胞の細胞株へと変換されることが確立されています。これらの観察結果は、血流中における間葉系前駆細胞の再循環が、骨髄の未熟な間質性要素の共通プールを動員することにより、様々な臓器の間質性幹細胞の組織バランスを維持していることを示唆しています。MSCが複数の間葉系表現型を持つ細胞に分化し、それらが生体内で骨、軟骨、脂肪組織、腱の再生または修復に関与することは、実験動物を用いた移植モデルを用いて実証されています。他の研究者らによると、軟骨修復、筋再生、その他の修復プロセスにおいて、血管床に沿ったMSCの遠隔移動は、組織内の多能性間葉系前駆細胞の短距離または局所的な移動と組み合わされています。

間質組織基底部の局所的な幹細胞は、生理的な組織再生過程における細胞源として機能し、間質組織幹細胞の資源が消費されると、遠隔輸送されたMSCによって補充されます。しかし、多発外傷など、修復細胞能の緊急動員が必要となる状況では、MSCの全階層が修復再生過程に関与し、骨髄の間葉系前駆細胞が全身の血流を通じて末梢へと動員されます。

間葉系幹細胞移植

生理的な組織再生過程と子宮内発育における組織形成の間には、ある種の類似点が見受けられる。ヒトおよび哺乳類の胚発生においては、外胚葉、中胚葉、内胚葉の胚葉プールから様々な種類の特殊細胞が形成されるが、間葉組織が必須の役割を果たしている。胚間葉組織の緩やかな細胞ネットワークは、数多くの調節機能、代謝機能、骨格形成機能、そして形態形成機能を果たす。仮臓器の設置は、器官形成の主要な形態形成シグナルを生成する前駆細胞のクローン形成による間葉組織の凝縮後にのみ起こる。胚間葉組織の間質性派生物は仮臓器の細胞骨格を形成し、主要な血管およびリンパ管の成長による将来のエネルギー可塑性供給の基盤となる。言い換えれば、胎児臓器の微小循環ユニットの間質性要素は、それらの構造的および機能的単位が形成される前に発生する。さらに、器官形成中の間葉系細胞の活発な移動は、ホメオティック Hox タイプの制限を通じてそれらの体積境界をマークすることにより、発達中の器官の空間的な方向性を提供します。間質フレームワークは、形態形成的および機能的に完全に異なる細胞を含むことが多い実質器官の構造的および機能的単位の組み立ての基礎としても機能します。その結果、胚発生中は、間葉系の機能が主要なものとなり、前駆上皮細胞の局所的な増殖と分化を活性化する制御シグナルの生成を通じて実現されます。胚間葉系細胞は HGF-b、HGF-b、CSF などの成長因子を産生し、実質前駆細胞はこれらの因子に対応する受容体を有します。成体生物の分化した成熟組織では、細胞の間質ネットワークが、非間葉系起源の前駆細胞の生存能力と増殖を維持するためのシグナルも生成します。しかし、出生後の個体発生における間質性調節シグナルのスペクトルは異なり（SCF、HGF、IL-6、IL-1、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、GM-CSF、flt-3、LIFなど）、損傷した組織領域の生理的再生または修復を確実にすることを目的としています。さらに、組織の種類ごとに、さらには1つの臓器内でも、間質性調節因子のスペクトル特性は異なります。特に、造血細胞と免疫担当細胞の増殖と分化を伴う造血とリンパ球産生は、間質性微小環境が機能する特定の臓器でのみ発生し、その境界内で造血細胞とリンパ球細胞の成熟のための条件が整えられます。造血細胞とリンパ球細胞が特定の臓器に再定着し、その微細構造ニッチで増殖し成熟する能力は、微小環境の調節因子に依存します。

多能性間葉系前駆細胞が産生する細胞外マトリックスの成分としては、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、そしてCD44（ヒアルロン酸およびオステオポンチン受容体）が挙げられます。これらは、骨髄および骨組織における細胞間相互作用の組織化と細胞外マトリックスの形成に主要な役割を果たしています。骨髄多能性間葉系前駆細胞は、MSCだけでなく、造血前駆細胞や骨髄の他の非間葉系幹細胞にも誘導および制御シグナルを提供する間質性微小環境を作り出すことが証明されています。MSCの造血への関与は、造血をサポートする間質細胞への分化能力によって決定され、この指示シグナルは造血幹細胞から直接MSCに受信されることが知られています。このため、培養では間質前駆細胞のネットワークが、造血細胞のすべてのクローンの発達のためのフィーダー基盤として機能します。

成熟した生物においては、造血およびリンパ球産生の強度は、末梢における成熟血液細胞および免疫系細胞の「消費」と動的平衡状態にある。骨髄およびリンパ器官の間質細胞は極めて稀にしか再生されないため、それらの間質構造の大幅な再構築は起こらない。造血器官またはリンパ器官のいずれかに機械的損傷が生じると、このシステムは動的平衡から外れる可能性があり、その結果、損傷を受けた器官の間質構造と同様に、造血要素またはリンパ要素だけでなく、均一な連続的変化が生じる。修復的再生の過程では、まず間質基盤が形成され、その後、造血細胞または免疫担当細胞が再び増殖する。この古くから知られている事実により、外傷後の再生は、造血器官の間質微小環境を研究するための便利なモデルとなる。特に、管状骨の髄腔を機械的に空にすることは、骨髄の修復再生、すなわち掻爬術の研究に用いられます。掻爬術では、造血組織を動的平衡状態から迅速かつ効果的に除去することができます。モルモットの脛骨髄腔を機械的に空にした後、骨髄の造血および間質成分の修復再生のプロセスを研究したところ、造血細胞と間質細胞の再生指標（造血細胞数、間質前駆細胞の濃度と数）間に直接的な相関関係がないことがわかりました。さらに、掻爬術後、間質前駆細胞集団の増加はより早い時期に起こり、間質線維芽細胞自体が骨形成組織に特徴的なホスファターゼ陽性になることが判明しました。また、3～5 個の管状骨を掻爬すると、手術を受けていない骨の骨髄、さらにはモルモットではリンパ球産生のみを行う臓器である脾臓でもこの細胞集団が増殖することが確認されています。

モルモットの脛骨掻爬後の骨髄における修復過程の形態学的像は、他の動物種の実験で得られた文献に記載されているデータと概ね一致しており、造血組織の除去後に生じる変化のダイナミクスはすべての動物種で同じであり、違いは時間パラメータのみに関係しています。形態学的には、空になった骨髄腔における造血回復の段階的順序は、血栓の形成、粗い線維性骨組織の形成、その吸収、洞様毛細血管の発達、および網状間質の形成という連続的なプロセスで構成され、その後、網状間質に造血要素が再び増殖します。この場合、骨髄組織の再生過程における造血前駆細胞の数は、造血幹細胞の含有量の増加と並行して増加します。

Yu. Gerasimovら（2001）は、再生過程の各段階における造血細胞数と間質性前駆細胞数の変化を比較した。掻爬骨における骨髄細胞の量的変化は、再生の形態学的特徴のダイナミクスと対応していることが判明した。著者らは、最初の3日間の再生骨における細胞含有量の減少を、骨端線領域で保存された骨髄内の増殖性網状組織によって作り出された微小環境の悪影響による造血細胞の死、および後者における類骨組織病巣の形成と掻爬中の血管損傷と関連付けている。7～12日目には、有核細胞レベルの増加が、間質要素の増殖領域における骨髄造血の個々の病巣の出現と一致している。 20日目には、再生した骨髄の顕著な領域と十分に発達した副鼻腔が出現し、総細胞数の有意な増加を伴います。しかしながら、この期間の造血要素数は対照群の68%にとどまっています。これは、掻爬術後の造血細胞数が術後35～40日目にのみ正常値に達するという、以前に発表されたデータと一致しています。

外傷後早期においては、造血回復の主な源は掻爬時に保存された局所細胞成分である。後期においては、骨髄造血組織の再生の主な源は、遊離間質層を再増殖する幹細胞である。間質細胞の個々のカテゴリー（内皮細胞、網状細胞、骨芽細胞）に関しては、骨髄腔の再編成中にそれらの形成を確実にする源は依然として不明である。Yu. V. Gerasimovら（2001年）の研究結果によると、掻爬後に保存された骨髄では、線維芽細胞のコロニーを形成する細胞の濃度が正常骨髄よりも有意に高いことが示された。著者らは、掻爬によって、間質の形成に関与し、造血細胞よりも間質の主要成分と強く結びついているコロニー形成間質細胞と比較して、造血細胞がより集中的に選択的に除去されると考えている。

線維芽細胞コロニーを形成する細胞数の変化のダイナミクスは、骨形成過程の強度、それに続く骨梁の吸収、そして造血細胞が集積する網状間質の形成と相関している。再生期の間質前駆細胞のほとんどは、粗い線維性骨組織と網状間質を形成する。長期骨接合条件下での大腿骨骨折の場合、再生域の5日目には線維芽細胞コロニーを形成する細胞の濃度と数が増加し、集中的な骨形成期間中はその数が6倍に増加する。線維芽細胞コロニーを形成する骨髄細胞には骨形成特性があることが知られている。掻爬された骨髄領域に造血細胞が定着する前に、間質前駆細胞の数が増加する。これは、間質細胞が造血微小環境の形成を促進するというデータとよく一致している。明らかに、造血微小環境の形成は一定レベルの間質組織の再生に対応しており、造血に適した間質プラットフォームの拡大とともに造血細胞数が増加する。

最も興味深いのは、掻爬直後から骨格の遠隔部位における間質性前駆細胞数が増加するという著者らのデータである。6時間目から20日目まで、対側脛骨において線維芽細胞コロニーを形成する細胞の濃度と数はともに2倍以上に増加することが観察される。この現象のメカニズムは、広範囲の骨髄損傷が多数の血栓形成を招き、同時に相当数の血小板が破壊され、血小板由来増殖因子（PDGF）が血中に放出されることと関連していると考えられる。PDGFは、増殖プール外の体内に存在する線維芽細胞コロニーを形成する細胞の増殖を引き起こすことが知られている。ウサギを用いた実験では、MSCの局所投与が外科的に損傷した膝関節の軟骨組織の修復を促進し、これは注入されたMSC由来の軟骨細胞の形成と関連している可能性がある。しかしながら、実験用ラットにおける骨欠損部の修復再生は、セラミックフレームワーク内に封入された間葉系幹細胞を用いることで著しく促進される。したがって、RBOCではなく、損傷した間質細胞に由来する何らかの因子が、健常骨髄領域における間葉系前駆細胞の増殖に遠隔刺激作用を及ぼし、骨髄欠損部への遊走を刺激していると考えられる。しかしながら、これは、微小環境を担う間質細胞は造血細胞とは異なり、遊走能を持たず、局所起源であることを示唆する過去の文献データと矛盾する。

しかしながら、Yu. Gerasimovら（2001年）の研究結果によると、機械的外傷は掻爬骨の間質組織の急激な再構築を引き起こすだけでなく、損傷を受けていない遠隔骨の間質にも重大な変化をもたらすことが示唆されています。つまり、局所外傷に対する間質組織の全身反応が見られるのです。さらに、多発外傷（多発掻爬）が発生すると、この反応は増強され、手術を受けた骨や骨格の遠隔部だけでなく、リンパ器官、特に脾臓にも観察されます。骨髄と脾臓の間質組織が局所外傷や多発外傷に対してこのような全身反応を示すメカニズムは未だ解明されていません。このプロセスは、骨髄髄腔の間葉系間質から分泌される体液性因子の作用に関連していると考えられています。骨髄と脾臓の間質細胞によって、線維芽細胞コロニーを形成する細胞の増殖に関与する臓器非特異的体液性因子が生成される可能性は、骨髄の単層培養におけるコロニー刺激活性に関するデータによって証明されています。

この点において注目すべきは、多能性間葉系幹細胞を全身投与すると、その派生細胞が骨髄だけでなく他の組織にも再増殖し、特に遺伝子治療に用いられることです。コラーゲンI遺伝子に変異を持つマウスに野生型ゲノムを持つ大量のMSCを静脈内投与すると、ドナー細胞がレシピエントの骨および軟骨組織の細胞の最大30%を置換することが示されています。また、ヒトIL-3を分泌するトランスフェクトされたマウス間葉系幹細胞をヒト造血幹細胞と同時に免疫不全マウスに投与すると、9ヶ月間にわたり造血を効果的にサポートすることが示されています。

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間葉系幹細胞の遺伝子改変

MSCの実験的遺伝子改変における成功例の中でも、第IX因子遺伝子をヒトMSCに導入し、その後、導入細胞を免疫不全マウスに移植することで、移植後8週間にわたり血中に抗血友病性B因子が出現するという成果は特筆に値します。この実験では、導入細胞においてγ-グルタミルカルボキシラーゼによる第IX因子の翻訳後修飾が行われました。ヒト第IX因子をコードするレトロウイルスベクターを用いたMSCへの形質導入は成功率が低く、その後、これらの細胞を血友病Bのイヌに投与したところ、わずか12日間、正常な凝固強度を維持しながら治療レベルの第IX因子が得られました。

動物の脳実質への間葉系幹細胞の移植により、ドナーの未熟細胞がニューロンとグリア細胞の両方の集団へと分化することが示されています。健康なドナー間葉系組織のニューロン由来細胞を移植することで、理論的にはゴーシェ病やその他の脂質、ガングリオシド、または炭水化物代謝異常を持つ患者の脳代謝における遺伝子異常を修正することが可能になります。

骨髄間質幹細胞を神経系および肝組織前駆細胞へと分化転換させる条件を実験的に探索中です。研究者らは、分化誘導剤と特殊な培養上清の組み合わせに注目しています。特に、間質細胞の一次培養を分離するために、洗浄した骨髄細胞を10%ウシ胎児血清を含むDMEM/F12（1/1）培養液に再懸濁し、200,000個/cm2の密度で播種します。24時間後、非接着細胞を除去し、プラスチックに付着した線維芽細胞様細胞を1週間培養します。骨髄間質細胞の神経芽細胞への分化誘導には、マウス胎児線維芽細胞の初代培養物を3日間培養した馴化培地と、2%ウシ胎児血清を添加し、20 ng/ml NFまたは10-6 Mレチノイン酸（マウスおよびヒト胎児幹細胞の神経分化誘導因子）を添加したDMEM/F12培地（1/1）を用いる。骨髄間質細胞の肝細胞前駆細胞への分化誘導は、マウス胎児肝細胞の初代培養物を10%ウシ胎児血清を添加したDMEM/F12培地（1/1）で3日間培養した馴化培地を用いて行う。

ここで改めて注目すべきは、骨髄間質のコロニー形成細胞は異形性があり、2 つのタイプに分けられるということです。第 1 タイプには、大きな核と 1 つまたは 2 つの核小体を持つ糸状仮足を形成する線維芽細胞様細胞が含まれます。第 2 タイプは、小さな紡錘形の細胞によって表されます。初代マウス胎児線維芽細胞のフィーダー層で得られた馴化培地で両方のタイプの細胞を培養すると、3 ～ 4 日目に神経芽細胞に似た細胞が培養物中に出現します。この段階では、ほとんどの場合、糸状仮足で終わる 1 つまたは 2 つの長い突起を持つ紡錘形の形状をしています。短い樹状突起を持つ錐体細胞または星状細胞はあまり一般的ではありません。一部の神経芽細胞の樹状突起には、特徴的な膨張 (成長芽) と遠位部の分岐がありますが、他の神経芽細胞には、樹状突起が成長する糸状仮足を持つ明確な成長円錐があります。ニューロンへ分化する神経芽細胞に固有の類似の形態学的特徴（芽および糸状仮足を伴う成長円錐）は、神経発生に関する研究で詳細に記述されています。これに基づき、一部の著者は培養物中に発見された細胞が神経芽細胞であると結論付けています。特に、E. Shchegelskayaら（2002）は、3～4日ごとに交換する調整培地で間質細胞の一次培養を2週間行った後、一部の細胞が未分化状態を維持しながら増殖することを発見しました。外見上、これらの細胞は線維芽細胞に似ており、分化中の神経芽細胞とともに培養物中に検出されました。細胞の大部分（約80%）は、神経組織の細胞、主にニューロンへの分化のさまざまな段階にありました。これらの細胞の樹状突起は互いに密接に接触していたため、細胞は長い多細胞ストランドの形で基質上に徐々に神経ネットワークのセクションを形成しました。神経芽細胞の樹状突起は著しく長くなり、その一部はニューロン体自体の長さの8～10倍を超えました。錐体細胞と星状細胞の割合は徐々に増加しました。星状細胞の樹状突起は分岐しました。著者らによると、紡錘形細胞と比較して錐体細胞と星状細胞の分化が遅いことは、動物における正常な神経発生の段階の順序に対応しています。その結果、著者らは、骨髄間質幹細胞が誘導神経発生を起こし、その過程で3つの主要なニューロンタイプすべてがin vitroで神経芽細胞から形成されると結論付けています。2％胎児血清と20 ng/ml LIFを含む培地で骨髄間質細胞を3～4日間培養した際にも、神経細胞前駆細胞が検出されました。しかし、この場合、幹細胞の分裂は非常に遅く、神経芽細胞への分化は30％のケースでのみ発生し、ニューロンネットワークは形成されませんでした。レチノイン酸を神経細胞分化の誘導剤の一つとして用いて、培養物中の神経細胞の最大25～30％を得た。グリア細胞は主にアストロサイトとオリゴデンドロサイトで構成されている。ニューロンは、紡錘形細胞、錐体細胞、星状細胞の3種類すべてで構成されていたが、全神経細胞の3分の1に過ぎなかった。レチノイン酸を含む培地で間質細胞を培養して6日目に、神経細胞はさらに分化し、個々の錐体ニューロンに軸索が見られ、これは通常の神経発生では樹状突起の形成よりも遅れて現れる。著者らによると、神経細胞の収量が少ないにもかかわらず、レチノイン酸誘導法には利点がある。オリゴデンドロサイトとアストロサイトは、樹状突起と軸索の成長中に髄鞘形成と栄養機能を果たし、神経組織の正常な形成に必要である。したがって、生体内での損傷領域の修復には、グリア細胞を豊富に含むニューロン懸濁液を使用する方が良い。

第二の実験シリーズでは、著者らは骨髄間質細胞から肝細胞への分化誘導を試みた。マウス胎児肝細胞を培養して得られた馴化培地で骨髄間質幹細胞を3日間培養したところ、大きな球状細胞が観察された。これらの細胞は二核であることも多く、様々な大きさの細胞質封入体を有していた。これらの細胞は分化の段階が異なり、大きさ、核数、細胞質封入体が異なっていた。これらの細胞のほとんどでグリコーゲンが検出され、著者らはこれを肝細胞前駆細胞と同定した。培養物中に神経芽細胞に類似した細胞は認められなかったため、胎児肝細胞の培養から得られた馴化培地には神経細胞の分化因子が欠如しており、逆に骨髄間質細胞から肝細胞前駆細胞への分化を誘導する因子が含まれていると結論付けられた。結論として、著者らは、骨髄間質細胞が、使用される特定の培養液と誘導物質に応じて体外で神経組織細胞または肝臓組織細胞に分化することから、骨髄間質細胞には多能性が存在すると示唆している。

実際、いくつかの研究では、骨髄間質細胞が心筋細胞、軟骨細胞、骨、神経組織細胞へと分化することが正確に示されています。骨髄細胞の中には、肝細胞へ分化できる幹細胞集団が存在するという証拠もあります。これらのデータを考慮すると、上記のマウス実験結果は、成体生物の様々な組織の細胞へ分化できる多能性間葉系幹細胞が骨髄中に存在することをさらに裏付けるものと言えるでしょう。

間葉系幹細胞移植

臨床移植学において、ヒト間葉系幹細胞は、造血幹細胞およびその早期分化誘導された子孫細胞の増殖を確実にするために用いられます。特に、高用量化学療法後のがん患者に自己造血幹細胞およびMSCを投与することで、末梢血中の好中球数および血小板数の回復が促進されます。間葉系幹細胞の同種および自己移植は、造血組織間質の一次的欠損に関連する疾患である多発性骨髄腫、再生不良性貧血、および自然発生性血小板減少症の治療に用いられます。腫瘍血液病理学における細胞療法の効率は、多くの場合、間質幹細胞と造血幹細胞の同時導入によって向上します。これは、術後の造血回復期間の短縮、局所および循環癌細胞の非選択的破壊（患者自身の造血前駆細胞も死滅）による致命的な結果の数の減少として現れます。臨床診療においてMSCやその他の多能性間葉系前駆細胞を使用する見通しは、骨髄穿刺液からの比較的容易な取得、培養による増殖、および治療遺伝子のトランスフェクションによるものです。同時に、多能性間葉系前駆細胞の局所移植は局所組織欠損を補うために使用でき、間葉系起源の組織の全身機能不全の場合には、全身血流への導入が排除されません。

局所移植、全身移植、遺伝子治療におけるMSCの利用可能性を間質細胞生物学の観点から分析した研究論文の著者らは、より慎重な推論を行っている。出生後骨髄は伝統的に、明確に定義された細胞株からなる2つの主要なシステム、すなわち造血組織自体とそれに関連する支持間質から構成される臓器と考えられてきた。したがって、骨髄間葉系幹細胞は当初、造血微小環境の調節因子を産生するための間質性基盤の供給源としてのみ考えられていた。その後、研究者の関心は、骨格組織の幹細胞供給源としてのMSCの役割の研究へと移った。最新のデータは、骨髄間質細胞が神経組織または筋組織を形成する分化の予期せぬ可能性を示している。言い換えれば、間葉系幹細胞はトランスジェニック可塑性、すなわち元の組織の細胞とは表現型的に無関係な細胞型に分化する能力を示す。同時に、骨髄間質細胞の生物学的側面は、一般的な生物学的観点からも個々の詳細においても依然として不明確かつ未解決のままである。これには、骨髄間質細胞の同定、性質、起源、発達、生体内での機能、そして生体外での許容分化能、そして生体内での治療的利用の可能性などが含まれる。MSCの潜在能力に関する得られたデータ、ならびに他の幹細胞の再生能力に関する研究結果は、生物学において確立された定説とは著しく矛盾している。

低密度で培養すると、骨髄間質幹細胞はそれぞれ単一の前駆細胞に由来する明確なコロニーを形成します。有核骨髄細胞中の間質前駆細胞の割合はコロニー形成能によって決まり、培養条件とMSC種の両方に大きく依存します。例えば、げっ歯類では、最大数の間質前駆細胞を得るために、培養物中に照射骨髄フィーダー細胞と血清が存在することが絶対的に必要ですが、ヒトでは、間葉系幹細胞のコロニー形成効率はフィーダー細胞と培養培地の両方に依存しません。間質前駆細胞の増殖を刺激する既知の分裂促進因子の数は限られています。これらには、PDGF、EGF、FGF、TGF-b、IGF1が含まれます。最適な培養条件下では、ポリクローナルMSC株はin vitroで50回以上の細胞分裂に耐えることができ、1mlの吸引物から数十億の骨髄間質細胞を得ることができます。

しかし、骨髄間質細胞の集団は不均一であり、コロニーの大きさのばらつき、形成速度の差、そして線維芽細胞様の紡錘形から大型の扁平細胞まで、多様な細胞形態を呈する。このような培養の発達過程において、20日後には表現型の不均一性も認められる。一部のコロニーはアルカリホスファターゼの高発現を特徴とし、他のコロニーは全く発現しない。さらに、中心部がホスファターゼ陽性で、周辺部がホスファターゼ陰性のコロニーもある。個々のコロニーは骨組織の結節を形成する（マトリックスの石灰化の開始は、アリザリンレッド染色またはVan Koss染色法によるカルシウム染色によって示される）。他のコロニーでは、オイルレッドを用いたG染色によって識別される脂肪蓄積が見られる。稀に、間葉系幹細胞のコロニーはアルシアンブルー染色で染色される軟骨を形成する。

実験動物への異所性移植後、ポリクローナルMGK細胞株は、骨髄造血および脂肪細胞、そして稀に軟骨組織を伴う網状間質を有する異所性骨を形成する。骨髄間質細胞のモノクローナル細胞株を移植すると、キメリズムが観察される場合がある。キメリズムとは、ドナー由来の間質および脂肪細胞を含む骨組織細胞から構成される新生骨が、造血系および血管系の細胞がレシピエント由来であることを意味する。

これらの研究結果は、クローン株の由来となった骨髄間質前駆細胞の幹細胞の性質を裏付けています。また、培養下でクローン形成能を示すすべての細胞が真に多能性幹細胞であるとは限らないことも示唆しています。個々のクローンの真の分化能に関する最も信頼性の高い情報は、in vitroにおける派生細胞の表現型判定ではなく、移植後のin vivoにおいてのみ得られると考える研究者もおり、私たちもその意見に賛同します。培養における骨形成、軟骨形成、または脂肪形成の表現型マーカーの発現（mRNAまたは組織化学法によって判定）や、石灰化マトリックスの生成でさえ、in vivoにおける個々のクローンの多能性の程度を反映するものではありません。したがって、間質細胞群における幹細胞の同定は、生物学的移植アッセイの適切な条件下でのみ、事後的に可能です。特に、開放系移植システムでは軟骨形成が極めて稀にしか観察されないのに対し、拡散チャンバーや間質細胞のin vitroマイクロマス培養といった閉鎖系システムでは、局所的に低酸素圧が達成され、軟骨組織の形成が促進されるため、軟骨形成は珍しくありません。したがって、移植技術や非特異的なin vitro培養条件さえも、MSCの分化範囲に大きな影響を与えます。

特定の実験条件下での実験的移植は、骨髄間質細胞の分化能を決定するためのゴールドスタンダードであり、それらの同定における重要な要素です。歴史的に、骨髄間質細胞移植の研究は、骨髄移植の一般的な問題と関連しています。骨髄間質細胞株を移植することで造血微小環境が形成され、移植部位に造血組織の異所性発達をもたらすことが確立されています。微小環境はドナー由来、造血組織は宿主由来であることから、異所性骨は真の「反転型」骨髄移植とみなすことができます。骨髄間質細胞の局所移植は、自然治癒的再生よりも顕著な骨欠損の効果的な矯正を促進します。実験モデルを用いた複数の前臨床研究は、整形外科における骨髄間質細胞移植の可能性を説得力を持って実証していますが、これらの方法を最適化するには、たとえ最も単純な症例であっても、極めて慎重な作業と分析が必要です。特に、体外での骨芽細胞間質細胞の増殖に最適な条件は未だ確立されておらず、理想的なキャリアの構造と組成、そして骨の体積再生に必要な細胞数も未解明です。

体外培養で増殖させた骨髄間質細胞を間葉系由来の組織の再生に用いることに加え、MSCの特異な可塑性は、神経細胞の再生や中枢神経系への遺伝子産物の送達といった応用の可能性を切り開きます。原理的には、自己ヒト神経幹細胞を採取する必要がないため、神経系損傷に対する細胞療法が簡素化されます。骨髄細胞は、真性間質由来および間質外由来の心筋細胞および筋原前駆細胞の生成に応用できる可能性が報告されています。

一般的な骨格疾患の治療を目的とした骨髄間質細胞の全身移植に関する実験が進行中です。骨髄間質細胞が骨格疾患における遺伝性疾患の原因細胞であることは疑いようがなく、この細胞を用いた遺伝情報のベクター移入によって実験動物において病的な骨組織の形成がもたらされたことからもそれがよく分かります。しかし、間質細胞が全身の血流に導入された後に骨格骨に移植、生着、増殖、分化できるかどうかは、まだ証明されていません。

その理由の一つは、標準的な骨髄移植では間質が造血組織と共に移植されないため、全身投与された間質細胞の生着の成功を評価するための厳密な基準が未だ開発されていないことである。組織抽出物中のマーカー遺伝子の存在や培養中のドナー由来細胞の分離は、細胞の生着を示すものではなく、単に生存を示すだけであることに留意すべきである。骨髄微小血管系内にドナー由来細胞が多数存在するにもかかわらず、マウスの肢に骨髄間質細胞を動脈内注入した場合でも、生着は事実上ゼロとなる可能性がある。残念ながら、このような細胞は通常、体外培養でドナー細胞のマーカー遺伝子が検出されたという理由だけで「生着」とされる。さらに、研究対象の組織において、分化し機能的に活性なドナー由来細胞が長期にわたって統合されているという説得力のある証拠も提供されなければならない。骨髄間質細胞の骨格への生着に関する多くの論文において、この種の明確なデータが欠如していることは驚くべきことです。しかしながら、いくつかの正確な動物実験において、全身投与後に間質前駆細胞の限定的ではあるが確実な生着が確立されていることは注目すべきです。

これらのデータは、骨髄筋前駆細胞を血管系を介して筋肉に送達する可能性に関する研究結果と一致しています。しかし、骨格組織と筋組織はどちらも、発生および成長中に、血液循環を伴わない移動プロセスを使用する血管外細胞運動に基づいて形成されることを忘れてはなりません。前駆細胞を固相組織に送達するための独立した循環経路が存在する場合、生理的に循環する間葉系前駆細胞の存在を想定することは可能ですか？発生中および出生後の生物の両方におけるこれらの細胞の起源は何ですか、そしてそれらはどのようにして血管壁を貫通しますか？これらの疑問の解決は絶対に必要であり、最も注意深い前臨床分析が必要です。これらの疑問の答えが見出された後でも、骨格成長と結合組織のリモデリングに関連する問題のある運動学的側面は未解決のままです。同時に、変異した骨格前駆細胞全体を健康な間質細胞に置換することによる骨形成障害の治療は、臨床的に現実的な可能性を秘めているように思われます。この場合、病的な骨形成に起因する局所的な骨折部や変形、そして骨組織の破壊的な変化は、in vitroで培養された間質幹細胞を用いて修復可能です。したがって、今後の研究は、自己の変異した骨形成前駆細胞のex vivoにおける形質転換や遺伝子修復の問題に焦点を当てることが推奨されます。

短期的または永続的な細胞の遺伝子工学は、細胞生物学および分子生物学の基盤となり、in vitroおよびin vivoにおける細胞代謝における個々のタンパク質の役割に関する多くの科学的発見の源となっています。遺伝性病変およびヒト疾患の治療における分子技術の利用は、実用医療において非常に有望です。なぜなら、骨髄間質幹細胞の特性は、骨格の遺伝性疾患の治療のための独自の移植スキームの開発を可能にするからです。同時に、間葉系前駆細胞は将来の移植患者から容易に入手でき、遺伝子操作が容易で、短期間で大量に増殖することができます。間葉系幹細胞の使用により、血管内ベクター構築物を介して患者に直接遺伝情報物質を送達することに伴う制限やリスクを回避することができます。同様の戦略は胚性幹細胞にも適用できますが、自己出生後骨髄間質細胞は、移植後の免疫学的合併症の可能性を排除できるため、より好ましい材料です。例えば骨再生を促進するなどの短期的な効果を得るには、電気穿孔法、化学融合、リポフェクション、プラスミド、アデノウイルス構造体を用いた間葉系幹細胞の遺伝子改変が最適な方法です。特に、骨髄間質細胞へのBMP-2ウイルスの導入は、実験的な多発外傷における骨再生の促進に効果があることが証明されています。アデノウイルスベクター構造体の作成は毒性がないため好ましいですが、この場合の骨髄間質細胞の遺伝子改変は安定性が極めて低いという特徴があります。さらに、正常な形質転換骨髄間質細胞は、他の細胞タイプよりも10倍感染性の高い遺伝情報ベクターキャリアを使用する必要があり、これにより導入細胞の死亡率が大幅に増加します。

特定遺伝子の生物学的活性が低い、またはゼロであることによって引き起こされる劣性疾患の治療には、間葉系幹細胞の長期的または永続的な改変が必要であり、そのためにはアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノレトロウイルスキメラを使用する必要があります。これらのウイルスの輸送領域は、大きなDNAトランスフェクト（最大8 kb）を移送できます。科学文献では、IL-3、CD2、第VIII因子、およびL-DOPAの合成に関与する酵素などの調節およびマーカー分子の合成をコードするレトロウイルス構築物を導入した骨髄間質細胞の外因性生物学的活性がすでに報告されています。しかし、これらの研究においてさえ、著者らはこの技術の実用化前に克服する必要があるいくつかの制限を指摘しています。最初の問題は、体外MSC改変プロセスの最適化です。in vitroでの骨髄間質細胞の長期（3〜4週間）増殖は、それらのトランスフェクションを低下させることが知られています。同時に、MSCの高度な遺伝子改変を達成するには、複数回のトランスフェクションサイクルを実施する必要があります。2つ目の問題は、治療遺伝子の発現期間に関連しており、これは現在4ヶ月を超えていません。有効な遺伝子発現の自然な減少は、プロモーターの不活性化と改変細胞の死滅によるものです。間葉系幹細胞を用いた遺伝情報伝達の一般的な見通しを踏まえると、予備研究の結果は、体外トランスフェクション法のさらなる最適化、目的の方向に生物学的活性を制御する適切なプロモーターの選択、そして移植後の改変骨髄間質細胞の生体内における自己維持能力の向上の必要性を示唆しています。骨髄間質細胞を目的の方向に改変するためのレトロウイルス構造体の使用は、必ずしもそれらの移植を必須とするわけではないことに留意する必要があります。トランスフェクトされた間葉系幹細胞は、安定した定住を背景に、結合組織への必須の物理的な組み込みや機能なしに、矯正機能を発揮することができます。この場合、それらは体内で因子を生産する生物学的ミニポンプとみなされるべきであり、その欠乏により遺伝病理の発現が決定されます。

病的または異常な生物学的活性を有する遺伝子の発現を特徴とする優性遺伝病理の治療における形質転換骨髄間質細胞の使用は、歪んだ遺伝情報の伝達または発現を阻止する必要があるため、はるかに問題が多い。遺伝子工学の手法の一つは、トランスジェニック動物を作製するための胚性幹細胞の相同組換えである。しかし、相同組換えの頻度が極めて低いことに加え、組換え体の識別、分離、増殖に関する問題があるため、たとえ新たな技術的手法が開発されたとしても、近い将来、この手法が広く普及する可能性は低い。優性遺伝病理の遺伝子治療における第二のアプローチは、損傷したDNAの自動修復に基づいている。これは、損傷したゲノム内の相同遺伝子に結合する、所望の配列を持つ外因性DNA（短鎖DNAオリゴヌクレオチドまたはキメラRNA/DNAオリゴヌクレオチド）を導入することで、遺伝子変異を修復できるためである。 3 番目の選択肢は、病理情報の伝達をブロックすることです。これは、特定の遺伝子に結合して転写の可能性を排除する三元らせん構造を形成する特別に設計されたオリゴヌクレオチドを使用することで実現されます。

ゲノムレベルでの遺伝性疾患の修復は、依然として最も最適かつ好ましい治療法ですが、mRNAもまた、優性負性遺伝子を阻害するための有望なベクター（おそらくよりアクセスしやすいもの）です。mRNAの細胞生合成装置への結合を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは完全配列を持つタンパク質分子は、長年にわたり、翻訳阻害やmRNA分解促進に利用されてきました。さらに、二本鎖RNAは急速なmRNA分解を引き起こしますが、そのメカニズムは未だ解明されていません。しかし、短い変異または単一の変異を持つ変異アレルから転写されたmRNAを単に除去するだけでは、正常アレルのmRNA発現が促進される可能性は低いでしょう。代替案として、ハンマーヘッド型およびヘアピン型のリボシンセシスが挙げられます。これらはmRNAの非常に特異的な領域に結合し、翻訳中にそれらの切断と不活性化を誘導します。この方法を病的骨形成の治療に用いる可能性は現在研究されています。正確には何がターゲットであるか（ゲノム要素か細胞質要素か）に関係なく、新しい遺伝子治療技術の成功は、体外での骨髄間質細胞への試薬の組み込みの効率、特定のベクターの最適な選択、および間葉系幹細胞が体内で必要な因子を発現する安定した能力によって決まります。

このように、予期せぬ特性を持つ間葉系幹細胞の発見は、細胞株開発のための新たな概念体系を生み出しました。しかしながら、間質性幹細胞の生物学的役割、その性質、分化転換または脱分化能、胚発生、出生後成長、成熟、老化、そしてヒト疾患における生理学的意義を理解するためには、さらなる学際的研究が必要です。