1本のバイアルで2つのターゲット：100%の感度を誇るポータブルCRISPRベースの結核診断

複雑な機器を使わずに痰から直接検査できる携帯型結核検査に関する論文が、Science Advancesに掲載されました。等温DNA増幅とCRISPR読み取りを1本の試験管で組み合わせ、2つの保存的M. tuberculosis挿入配列（IS6110およびIS1081）を一度に検査し、さらにヒト遺伝子を内部サンプルコントロールとして用います。臨床サンプルを用いた小規模な「ブラインド」テストでは、培養と比較して感度100%（6/6）および特異度100%（7/7）が得られました。検出限界は、模擬痰中で約69～81 CFU/mlです。結果は紙の試験紙で確認でき、試薬は凍結乾燥されています（「コールドチェーン」なしで保管）。

背景

WHOによると、2023年には結核による死亡者数は約125万人に達すると予想されています。結核は再び感染症による死亡原因の第1位となり、推定1,080万人の感染者数に達しています。そのため、特に資源が限られた環境においては、アクセスしやすく迅速な診断が不可欠です。

• 現在の検査は、精度、速度、価格の間で妥協の産物です。「ゴールドスタンダード」と呼ばれる培養検査は非常に正確ですが時間がかかります。顕微鏡検査は高速ですが感度が低く、Xpert MTB/RIF UltraのようなPCRプラットフォームははるかに感度が高い（LOD ≈ 15.6 CFU/ml）ですが、高価な機器とカートリッジが必要であり、検査範囲が限られています。
• なぜ等温増幅とCRISPRなのか。等温RPA増幅は37～42℃で行われ、サーマルサイクラーを必要としないため、「現場で」便利です。CRISPR読み取り（Cas12/13）は種特異性を高め、複雑な光学系を必要とせずに視覚的なラテラルフロー（ストリップ）を可能にします。つまり、これは携帯型で安価なPVR検査への道です。
• なぜ2つのMBTターゲット（IS6110 + IS1081）を同時に使用するのか。IS6110はM. tuberculosis複合体の多重コピー挿入配列ですが、一部の株ではコピー数が少なく、IS6110のみの検査では「検出されない」可能性があります。2つ目のIS1081挿入配列を追加することで、偽陰性結果のリスクを低減できます。
• なぜ内部ヒトコントロールが必要なのか？呼気サンプルには阻害物質や「不良」サンプルが含まれている可能性があります。内部ヒトコントロール（例：RNase P/ゲノムDNA）は、サンプルが適切であり、反応が抑制されていないことを確認します。そうでなければ、結果は陰性とはみなされません。
• ワンポットフォーマットはそれ自体が重要です。手順が減り、汚染のリスクが低減し、実験室外での作業が容易になります。結核に対するこのようなアプローチは既に実現可能性を示していますが、今回の研究ではこのアイデアを内部対照を用いたデュアルターゲットフォーマットに拡張し、試薬の凍結乾燥とストリップリーダーの実装を実証しました。
• 本論文の価値は何でしょうか？著者らは、最も簡略化されたサンプル調製法を用いて痰から直接検出できること、模擬痰で約70～80 CFU/mlの検出限界、そして臨床サンプルの小盲検セットで100%の感度/特異度を達成したことを実証しました。これは、多施設共同での更なる検証に向けた優れた「技術デモ」となります。

これはどのように作動しますか

• 研究者たちは、RPA（37℃での遺伝物質の迅速等温増幅）と「切断」酵素Cas13a/Cas12aを組み合わせました。ガイドRNAを選択した後、2つのMBT標的を同時に、そしてヒトDNAと並行して標的とするようにシステムを構築しました（サンプル中に標的が存在し、反応が「停滞」していないことを確認しました）。
• すべての化学反応は 1 つの試験管内で行われ、培養後、結果は蛍光計またはラテラルフローストリップで読み取られます。基本的には迅速検査のようなものです。
• 喀痰処理は、核酸抽出器を使わずに、加熱と短時間の遠心分離のみに簡略化されています。最も限定的な状況では、著者らは遠心分離に代わる手動の代替手段についても検討しています。

テストの結果

• 検出限界：スパイク喀痰中、69.0 CFU/ml（H37Rv株）、80.5 CFU/ml（BCG株）。他の細菌／真菌との交差反応は検出されませんでした。
• 臨床設定（盲検化サンプル）：実臨床から採取した13検体において、播種に対する感度（6/6）および特異度（7/7）はそれぞれ100%でした。比較のため、同じキットでGeneXpert Ultraを用いた場合、感度はそれぞれ100%、特異度は86%でした。
• 技術的なニュアンス：2つの読み取りオプションのうち、Cas13aの方がより優れた結果が得られました（「ワンポット」フォーマットでは、Cas12aよりも感度が高いためです）。さらに、2つのMtbターゲットを並行してテストすることで、誤った結果が出るリスクが軽減されます。

なぜこれが必要なのでしょうか?

今日の検査は、精度、スピード、そして入手しやすさの間で妥協の産物です。培養検査は非常に正確ですが時間がかかります。綿棒検査は迅速ですが不正確です。GeneXpertのようなPCRシステムは正確で迅速ですが、高価な機器とカートリッジが必要です。新しいCRISPRアプローチは、このギャップを埋めることを目指しています。37℃で作動し、紙ストリップで読み取りを行う現場診断と、冷蔵せずに試薬を保管できる可能性です。

限界と今後の展望

これは小規模な臨床セットでの初期検証であり、大規模な多施設試験（小児におけるHIVの重複感染、少桿菌型、および異なるMBTラインを含む）が必要です。著者らは別途、「現場」バージョン自体では、卓上遠心分離機を完全に手動のソリューションに置き換える必要があると指摘しています。しかし、1つの試験管に「2つのターゲットと内部コントロール」を備えたアーキテクチャ自体は既に操作性が実証されており、大量使用に向けた改良への明確な道筋を示しています。

出典：Alexandra G. Bell他「喀痰から直接結核を検出する、CRISPRベースの簡略化された検査」、Science Advances、2025年8月6日オンライン版（第11巻、第32号）。DOI : 10.1126/sciadv.adx206